Temat: Zastosowanie metody FISH do oceny niestabilności chromosomów 1, 2 i 4 w limfocytach pacjentów diagnozowanych oraz leczonych jodem promieniotwórczym
(Application of FISH method to estimation of chromosomes 1, 2 and 4 instability in lymphocytes of patients undergoing diagnosis and treatment with Iodine-131)

Promotor: dr Justyna Miszczyk, tel.: 662 84-09
e-mail: Justyna.Miszczyk@ifj.edu.pl


Opis:

1. Do najczęstszych nie nowotworowych chorób gruczołu tarczowego, czyli tzw. tarczycy należą: wole czyli powiększenie gruczołu tarczowego, a także zaburzenie czynności tarczycy w tym szczególnie nadczynność i niedoczynność. Nadczynność tarczycy występuje u około 2% dorosłej populacji, dzieci chorują ponad 10 razy rzadziej, a u kobiet nadczynność stwierdza się 5-krotnie częściej niż u mężczyzn. Powszechnie wykorzystywanym w diagnostyce i leczeniu nadczynności tarczycy izotopem jest 131I. Przyjmuje się, że terapia jodem radioaktywnym jest metodą skuteczną i bezpieczną, jednakże jest niewiele doniesień odnośnie optymalizacji metody, narażenia tkanki zdrowej i otoczenia pacjenta. Szczególny brak odczuwa się w ocenie zmian prowadzących na poziomie komórkowym do podwyższenia ryzyka późnych i ubocznych procesów patogennych lub wręcz nowotworowych. Do najlepszych biologicznych markerów tego typu zmian należy niestabilność chromosomów oznaczana najczęściej w limfocytach pacjentów lub osób badanych. Najbardziej nowoczesne metody cytogenetyczne, która dają możliwości oceny ryzyka utraty zdrowia z równoczesną możliwością głębokiego poznania struktury powstałych zaburzeń są oparte na zastosowaniu techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ znanej jako FISH (ang. Fluorescent in situ Hybridisation).

Celem proponowanych badań porównawczych jest ocena niestabilności chromosomów 1, 2 i 4 w limfocytach pacjentów diagnozowanych, a następnie leczonych jodem promieniotwórczym (131I) oraz osób z grupy kontrolnej, w oparciu o pomiar aberracji stabilnych (translokacji, delecji, insercji) i niestabilnych (fragmentów acentrycznych) z zastosowaniem techniki FISH.

2. Metoda FISH polega na hybrydyzowaniu (łączeniu) odpowiednio skonstruowanej sondy molekularnej (sekwencja kwasów nukleinowych związana z fluorochromem zsyntetyzowana in vitro jako komplementarny odcinek do fragmentu DNA, który ma być zbadany lub jest poszukiwany) i wiązaniu się z DNA badanym. Procedura przygotowywania preparatów do analizy metodą FISH składa się z następujących etapów: stymulacja limfocytów do podziału, a następnie ich hodowla i zatrzymanie podziałów w metafazie, oraz przygotowanie preparatów oraz hybrydyzacja.

W proponowanych badaniach materiał biologiczny będą stanowiły limfocyty krwi obwodowej pobrane dwukrotnie od tego samego dawcy: po raz pierwszy od pacjenta po scyntygrafii (PDS) tuż przed podaniem mu dawki terapeutycznej I-131, następnie po raz drugi w 5 tygodni po podaniu jodu terapeutycznego dla pacjentów leczonych jodem (PLJ) oraz od zdrowych dawców należących do grupy kontrolnej. Badania prowadzone są we współpracy z Zakładem Medycyny Nuklearnej (5 Wojskowy Szpital Kliniczny z Polikliniką SP ZOZ, Kraków). Proponowany temat stanowi kontynuację i pogłębienie badań nad zróżnicowaniem indywidualnej wrażliwości komórkowej analizowanej w oparciu o odpowiedź limfocytów na dawkę pobudzająca (2 Gy) promieniowana X, z aparatu Rtg z lampą MCN 323, IFJ PAN [1].

Hodowle limfocytów z pełnej krwi zakładane były wg. standardowej procedury zalecanej przez IAEA [2], stymulowane do podziałów mitogenem komórkowym (PHA), po 70 h podziały zablokowano w metafazie działaniem kolcemidu, a po upływie 2 h od dodania kolcemidu, były utrwalane i nanoszone na szkiełka mikroskopowe, wg. procedury utrwalania przygotowującej materiał metafazowy do hybrydyzacji z sondą molekularną.

Na potrzeby niniejszej pracy planuje się użycie sond dla całych chromosomów 1, 2 oraz 4 oraz zastosowanie procedury hybrydyzacji zalecanej przez producenta sond. Sondy te znakowane są na kolor: czerwony (chromosom 1, Texas Red), zielony (chromosom 2, FITC), żółty (chromosom 4, mieszanina FITC i TEXAS Red) firmy Cytocell. Ilość analizowanych metafaz będzie wynikać ze statystycznego rozkładu któremu podlegają aberracje (rozkład Poissona) i częstości tych aberracji, a także stosowanej metody i jakości preparatu. Analiza preparatów będzie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (Nicon Eclipse E400), z zestawem filtrów DAPI/FITC/Texas Red oraz systemu do akwizycji obrazów połączonego z kamerą CCD. Przykładowe zdjęcia metafaz przedstawiają Fotografie 1-3.

Fot. 1.
Fot. 2.
Fot. 3.

Fot. 1-3. Przykładowe fotografie prawidłowych chromosomów 1, 2 i 4 (Fot. 1.), translokacji chromosomu 1 (Fot. 2.) oraz translokacji chromosomu 2 (Fot. 3.) wyznakowane w technice FISH wg. znakowania opisanego powyżej.

3. Temat pracy magisterskiej jaki proponujemy pozwoli przygotować przyszłego absolwenta kierunku Fizyka Medyczna: specjalność Dozymetria i Elektronika w Medycynie do pracy z materiałem biologicznym. Podczas pracowni magisterskiej student zapozna się z podstawowymi zasadami bezpiecznej pracy w laboratorium biologii radiacyjnej i cytogenetyczno-molekularnym oraz z materiałem komórkowym człowieka, praktycznie zaznajomi się ze strategią i planowaniem eksperymentów i zakładaniem hodowli komórkowych, oraz szczególnie z ideą cytogenetycznych badań molekularnych z wykorzystaniem techniki FISH. Ponieważ proponowana tematyka jest w Zakładzie NZ52 prowadzona równolegle z zastosowaniem innych metod badawczych cytogenetyki klasycznej (np. CA, SCE, MN), studentom w ramach ich praktyk, stażu oraz w ramach badań eksperymentalnych do pracy dyplomowej, daje to możliwość poszerzenia wiedzy o metodyki tych badań, ważnych dla wielu dziedzin ochrony zdrowia, takich jak prognostyka przedkliniczna, ochrona radiacyjna, radiologiczna, a także epidemiologia i higiena prewencyjna.

Uzyskana wiedza i praktyka stanowią narzędzie pozwalające na zrozumienie i w przyszłości praktyczne wykorzystanie podstaw i zasad doboru metod diagnostycznych pod kątem korzyści diagnostycznych jakie można dzięki poznanym technikom osiągnąć.

W trakcie odbywanych praktyk jak i podczas pracowni magisterskiej magistrant będzie miał możliwość:

  • uczestniczenia w eksperymentach z pracownikami Zakładu NZ52 IFJ PAN
  • nauki przeprowadzania analiz częstości aberracji stabilnych - translokacji metodą FISH, chromosomowych aberracji (CA) (niestabilnych - dicentryków, pierścieni i fragmentów acentrycznych- CSA), wymian chromatyd siostrzanych (SCE) oraz częstości mikrojąder (MN)
  • zapoznania się z obsługą różnych rodzajów mikroskopów (świetlnych i epifluorescencyjnych ) oraz programów informatycznych im dedykowanych, a także sprzętem niezbędnym do prowadzenia eksperymentów
  • analizy sporządzonych własnoręcznie preparatów oraz stworzenia własnej bazy danych i analizy rezultatów
  • dyskusji, analizy i prezentacji wyników podczas seminariów i spotkań z gośćmi z ośrodków naukowych, z którymi współpracuje Zakład
  • współtworzenia baz danych pacjentów w oparciu o uzyskane rezultaty
  • poszerzenia wiedzy o metody wykorzystywane w medycynie nuklearnej w diagnostyce i leczeniu nadczynności tarczycy izotopem jest 131I

4. Proponowany temat jest spójnie powiązany z badaniami naukowymi prowadzonymi w ramach grantu MNiSzW o numerze N N404 029635 przyznanego na lata: 2008-2011 pod kierunkiem Prof. dr hab. A. Cebulskiej-Wasilewskiej, przy współpracy z Zakładem Medycyny Nuklearnej, 5 Wojskowy Szpital Kliniczny z Polikliniką SP ZOZ, Kraków, stanowi kontynuację oraz pogłębienie tych badań w ramach wcześniej przygotowanej pracy magisterskiej Pani Joanny Łużny pod tytułem: "Ocena niestabilności chromosomu 1 z zastosowaniem metody FISH, w limfocytach pacjentów diagnozowanych oraz leczonych jodem promieniotwórczym"

5. Oczekuje się, że zbadanie w opisany sposób chromosomów 1, 2 i 4 w limfocytach pochodzących od wybranych pacjentów diagnozowanych oraz leczonych jodem promieniotwórczym (131I), w porównaniu do osób z grupy kontrolnej pozwoli określić osobniczą odpowiedź komórkową indywidualnego pacjenta, a także ocenić czy istnieje realne zagrożenie wzrostu ryzyka dla tkanki zdrowej w wyniku podania dawki jodu terapeutycznego w porównaniu do dawki diagnostycznej oraz do ryzyka obserwowanego u osób z grupy kontrolnej.

Dodatkowo, badania odpowiedzi komórek pacjentów na dawkę pobudzającą 2 Gy umożliwi ocenę wpływu niskiej dawki diagnostycznej oraz wysokiej dawki terapeutycznej na późne skutki wynikające z modyfikacji fenotypowej wrażliwości komórkowej na działanie innych czynników genotoksycznych obecnych w życiu i środowisku poszczególnych pacjentów.

Ponadto, proponowane badania umożliwią sprawdzenie częstości i typów aberracji chromosomów 1, 2 i 4 oraz pozwolą ocenić czy terapia jodem radioaktywnym może być optymalizowana w oparciu o proponowane metody badawcze.

Uzyskane przez magistranta rezultaty będą włączone w podsumowanie dotychczasowych badań asocjacji pomiędzy oceną osobniczej podatności pacjenta uzyskaną na poziomie molekularnym (z szybkim testem kometowym oceny radiowrażliwości i wydajności naprawy DNA), a radiowrażliwością komórkową wyznaczoną metodami klasycznej (CA, SCE, MN) i molekularnej (FISH) cytogenetyki. Wykazanie istniejącego przyczynowo-skutkowego powiązania pomiędzy badanymi biomarkerami jest niezbędne do zastosowania szybkiego testu radiowrażliwości i wydajności naprawy DNA w badaniach przedklinicznych w charakterze testu predykcyjnego.

Piśmiennictwo:
[1] J. Gąsiorkiewicz, M. Krzysiek, J. Miszczyk, A. Panek, J. Pawlus, A. Stępień, A. Cebulska-Wasilewska, (2010) "Studies on response to the challenging dose of X-rays in lymphocytes of patients undergoing diagnosis and treatment with iodine-131". in: Cebulska-Wasilewska, A., Osipov, A.N., Darroudi, F. (eds) Rapid Diagnosis in Populations at Risk from Radiation and Chemicals, ISBN 978-1-60750-644-7, IOS Press Amsterdam ,vol. 73, pp 211-220.
[2] Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment A Manual, International Atomic Energy Agency, Technical Reports Series No. 405, Vienna, 2001