Temat: Ocena funkcjonowania poszczególnych systemów naprawczych DNA oraz możliwości ich modyfikacji poprzez zastosowanie metylonikotynamidu oraz witaminy D w limfocytach pacjentów z diagnozą udarów
(Studies on the DNA repair efficiency and the possibility of its modification by the application of 1-methylnicotinamide and vitamin D in lymphocytes of patients with incerebrovascular accident diagnosis)

Opiekun pracy: dr Agnieszka Panek, tel.: 662 83-68, 662 84-82
e-mail: Agnieszka.Panek@ifj.edu.pl


Kierunek: Fizyka medyczna


Opis problemu badawczego:
W Polsce rejestruje się około 70 000 nowych zachorowań na udar rocznie, a zapadalność na tę chorobę określa na około 175/100 000 mężczyzn i 125/100 000 kobiet. Udar mózgu jest trzecią, co do częstości przyczyną śmierci u osób dorosłych. Ryzyko udaru mózgu rośnie wraz z wiekiem (średni wiek zachorowania około 70 lat). Przyczyną udaru są zaburzenia krążenia w mózgu. W 80% przypadków udar mózgu wywołany jest niedokrwieniem, czyli zamknięciem naczynia, które doprowadza krew do mózgu. W 20% udarów mózgu wywołane jest krwotokiem bądź to do mózgu, bądź do przestrzeni pomiędzy mózgiem a czaszką. W populacji europejskiej najczęstszą przyczyną udarów są zmiany miażdżycowe (ok. 40%) [1,2]. Etiologia ich nie jest do końca wyjaśniona. Styl życia, oraz środowiskowe lub zawodowe ekspozycje, w tym także na czynniki fizyczne (PEM, PM, promieniowanie) być może należą do czynników potencjalnie modyfikujących ryzyko ich powstawania.

Celem pracy magisterskiej będzie zbadanie wydajności systemów naprawczych DNA (NER, BER, NHEJ) w limfocytach pacjentów z objawami udarowymi oraz próba modyfikacji wydajności procesów naprawy DNA poprzez zastosowanie metabolitu witaminy B3, metylonikotynamidu (MNA+), posiadającego działanie przeciwzapalne i anty-trombotyczne [3] oraz witaminy D, której niedobór jest powiązany z rozwojem chorób krążenia [4]. Ponadto w badanej grupie przewiduje się pobór krwi zarówno od pacjentów z udarem krwotocznym jak i niedokrwiennym, co pozwoli na podjecie próby oceny różnic w działaniu badanych czynników w zależności od typu udaru. Wyniki uzyskane dla grupy udarowców zostaną porównane z rezultatami dawców z grupy kontrolnej, przebadanej we współpracy z 5 Wojskowym Szpitalem Klinicznym z Polikliniką w ramach grantu MNiSW (N404029635). Powyższe badania proponowane w ramach pracy magisterskiej powinny pozwolić na uzyskanie informacji czy zaburzenia w wydajności procesów naprawy DNA występują z większą frekwencją w grupie udarowców niż w grupie referencyjnej oraz czy metylonikotynamid lub witamina D może modyfikować powyższe procesy.

Metodyka badań:
Materiał biologiczny będący przedmiotem badań będą stanowiły limfocyty krwi obwodowej wyizolowane z próbek krwi pobranych od pacjentów z objawami udarowymi. Na potrzeby badań do pracy magisterskiej, magistrant wykona procedurę izolacji i mrożenia limfocytów z krwi obwodowej pacjentów. W dalszym etapie, wyizolowane limfocyty pobrane od pacjentów będą przedmiotem prowadzonych przez magistranta badań dotyczących oceny indywidualnej radiowrażliwości i wydajności komórkowych procesów naprawy DNA oraz możliwości ich modyfikacji poprzez zastosowanie potencjalnego czynnika radio-protekcyjnego (MNA+), wykazującego także działanie przeciwzapalne i anty-trombotyczne oraz witaminy D. Ocena radiowrażliwości i zdolności naprawczych limfocytów zostanie dokonana w oparciu o zaproponowany przez A. Cebulską - Wasilewską, model badań wydajności naprawy DNA z zastosowaniem dawki pobudzającej promieniowania X (3Gy) [4] oraz UV-C (6J/m2). Dzięki zastosowaniu 2 typów czynników genotoksycznych będzie możliwe przetestowanie różnych systemów naprawy tj. NER w przypadku promieni UV-C oraz BER i NHEJ przy zastosowaniu promieni X. W celu oceny możliwości modyfikacji indywidualnej radiowrażliwości i wydajności komórkowych procesów naprawy, wszystkie badania będą przeprowadzane jednocześnie dla komórek nie traktowanych jak i traktowanych chemicznie. Analiza indukowanych uszkodzeń DNA zostanie przeprowadzona metodą elektroforezy DNA jądrowego z pojedynczych komórek w żelu agarozowym (ang. SCGE) w pH>13 pozwalającą na ilościową detekcję uszkodzeń DNA takich jak pojedyncze i podwójne pęknięcia nici DNA, miejsca apurynowe oraz apirymidynowe.
W oparciu o wykonane preparaty magistrant samodzielnie przeprowadzi ilościową analizę uszkodzeń DNA przy użyciu epifluorescencyjnego mikroskopu BX-50 firmy Olympus (pow. 200x, 100W palnik rtęciowy, filtr wzbudzający 515-560 nm, filtr barierowy od 590 nm) połączonego z kamerą CCD oraz komputerem zawierającym program do analizy obrazu Komet 3.0 firmy Kinetic Imaging (Liverpool, UK) stanowiący wyposażenie Zakładu. Wydajność naprawy DNA na poziomie molekularnym zostanie oceniona w odniesieniu do poziomów i zmienności obserwowanych w badaniach grup dawców zdrowych, z referencyjnej grupy kontrolnej. Rys.1 Obraz DNA limfocytu analizowany programem Komet 3.0

Uzyskane wyniki w postaci wartości liczbowych dla 2 najczęściej wybieranych parametrów programu opisujących obraz DNA komórki po elektroforezie (procentowa zawartość DNA w warkoczu komety - %DNA, moment komety - MK) pozwolą magistrantowi na stworzenie bazy danych i przeprowadzenie analizy statystycznej.

Uzyskane umiejętności:
Podczas wykonywania pracy magisterskiej magistrant:

  • zapozna się z procedurami bezpiecznej i sterylnej pracy z materiałem biologicznym człowieka
  • nauczy się planowania i organizacji wykonania eksperymentów biologicznych
  • pozna budowę i podstawy pracy aparatu Rtg
  • posiądzie praktyczne umiejętności:
    • izolacji materiału biologicznego
    • wykonywania preparatów żelowych z zawiesiną komórek
    • przeprowadzania elektroforezy DNA w żelu agarozowym
    • analizy preparatów przy zastosowaniu mikroskopu epifluorescencyjnego
  • zapozna się z możliwościami i pracą programu do analizy obrazu Komet 3.0
  • przygotuje bazę uzyskanych rezultatów
  • przeprowadzi analizę statystyczną uzyskanych rezultatów z zastosowaniem podstawowych testów statystycznych.

Badania są prowadzone w ramach współpracy z Wojskowym Szpitalem Klinicznym z Polikliniką SP ZOZ.

Piśmiennictwo:
1. Raport zespołu ekspertów Narodowego Programu Profilaktyki i Leczenia Udaru Mózgu (2000)
2. Członkowska A., Ryglewicz D. (1996) Epidemiologia udarów mózgu. Terapia, 11: 9-16.
3. Chlopicki S. (2007) Br J Pharmacol
4. Pawlak M., Kasprzak J.D. (2011) Witamina D a rozwój chorób układu krążenia - przegląd piśmiennictwa, Polski Przegląd Kardiologiczny, 13(2):114-117.
5. Cebulska-Wasilewska A. (2003) Response to challenging dose of X-rays as a predictive assay for molecular epidemiology. Mut. Res .544: 289-297.