Temat: Ocena wpływu predyspozycji genetycznych na osobnicze zróżnicowanie odpowiedzi na promieniowanie X u pacjentów z chorobą nowotworową w odniesieniu do osób z grupy referencyjnej
(Studies of genetic predisposition influence on differentiation in individual cellular response to radiation of lymphocytes from cancer patients in comparison to reference group)

Promotor: prof. dr hab. Antonina Cebulska-Wasilewska, tel. 662 83-22
e-mail: b7wasile@cyf-kr.edu.pl

Opiekun prac eksperymentalnych: dr Justyna Miszczyk, tel.: 662 84-09
e-mail: Justyna.Miszczyk@ifj.edu.pl


kierunek: Fizyka medyczna


Opis:

1. Zakład Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej IFJ PAN (ZBRiŚ) od wielu lat rozwija najnowsze metody z zakresu genetyki molekularnej dotyczącej analizy w limfocytach człowieka biomarkerów skutku oraz podatności osobniczej na promieniowanie jonizujące oraz różnorodne czynniki kancerogenne. Liczne doniesienia naukowe i obserwacje epidemiologiczne wpływu różnego rodzaju czynników genotoksycznych (np. promieniowania) na komórki człowieka wykazały znamienne zróżnicowanie międzyosobnicze w odpowiedzi komórkowej [1]. To zróżnicowanie w radiowrażliwości fenotypowej jest funkcją wielu czynników osobniczych (płeć i wiek pacjenta, ekspozycja zawodowa i środowiskowa oraz w dużym stopniu jego predyspozycja genetyczna) jak również czynników związanych ze stylem życia (dieta, papierosy, aktywność fizyczna i intelektualna) i może być jednym z głównych czynników różnicujących populacje pod kątem zarówno ryzyka utraty zdrowia związanego ze wzrostem zapadalności na nowotwory w wyniku ekspozycji (wypadkowych, zawodowych czy środowiskowych) jak i skuteczności procedur leczniczych [1].

Jednym z ważniejszych źródeł osobniczego zróżnicowania jest polimorfizm genów enzymatycznego systemu metabolizującego i naprawy DNA, należącego do podstawowych procesów komórkowych. W populacji człowieka obserwowane indywidualne zróżnicowanie w tych procesach może być spowodowane występowaniem polimorficznych form genów, które kodują białka zaangażowane w biotransformację ksenobiotyków (pierwszą i drugą fazę) oraz naprawę DNA [2]. Zróżnicowanie osobniczej podatności na uszkodzenia DNA związane może być z szybkością i wydajnością takich procesów jak: tworzenie wolnych rodników oraz potencjalnie genotoksycznych produktów, ich usuwanie z komórki oraz naprawa powstałych uszkodzeń w DNA. Potwierdzają to między innymi rezultaty badań Prof. A. Cebulskiej-Wasilewskiej w dużych międzynarodowych projektach badawczych (grant UE - EC EXPAH QLK4-CT-2000-00091), które wykazały, iż genetyczny polimorfizm enzymów biotransformacji może wpływać na osobnicze zróżnicowanie w procesach naprawy DNA [3]. W skrajnych przypadkach może być przyczyną podwyższonego ryzyka utraty zdrowia. Dodatkowe czynniki związane ze stylem życia (nałóg palenia papierosów, dieta) modyfikują wydajność naprawy indukowanych uszkodzeń DNA, a spadek wydajności naprawy DNA, obserwowany w limfocytach osób eksponowanych na środowiskowe WWA może wpływać na wzrost ryzyka zachorowania na nowotwory [3].

Zatem na podstawie wymienionych doniesień naukowych możliwość natychmiastowej analizy wpływu genotypowej predyspozycji w radiowrażliwości pacjentów na poziom zmierzonych biomarkerów (w tym oceny radiowrażliwości DNA oraz wydajności naprawy jego uszkodzeń) jest niesłychanie istotna dla rzetelnego zastosowania retrospektywnej dozymetrii biologicznej do oceny ryzyka utraty zdrowia spowodowanego wypadkową i niekontrolowaną dozymetrycznie ekspozycją na promieniowanie jak również dla potrzeb indywidualizacji radioterapii.

W roku 2011 r. rozpoczęto w Zakładzie BRiŚ badania wpływu predyspozycji genetycznych (poprzez analizę wybranych polimorfizmów) na osobnicze zróżnicowanie odpowiedzi na promieniowanie X u wybranych pacjentów z obniżoną lub podwyższoną radiowrażliwością. Wstępne rezultaty w ramach prezentacji plakatowej pt.: "Genetic polymorphisms in XRCC1 and XRCC3 influence on the susceptibility to ionizing radiation and risk of cancer" zaprezentowano na Sympozjum Satelitarnym 14-tego Światowego Kongresu Badań Radiacyjnych, "Physical and biological basis of hadron radiotherapy" w Krakowie. Uzyskane interesujące rezultaty wstępne wymagają jednak badań dla większej grupy pacjentów.

Celem proponowanych badań jest ocena wpływu predyspozycji genetycznych na zróżnicowanie indywidualnej odpowiedzi komórkowej na promieniowanie. Ocena predyspozycji genetycznych zostanie wykonana w oparciu o analizę polimorfizmów wybranych genów kodujących enzymy naprawy DNA zaangażowanych w poszczególne systemy naprawy uszkodzeń pojedynczej nici DNA: BER (Base Excision Repair): XRCC1 (Arg194Trp) (Arg399Gln), podwójnoniciowych pęknięć w DNA: HR (Homologus Recombination): XRCC3 (Thr241Met) [4], a następnie na tej podstawie rozpoczęcie opracowania bazy danych wpływu polimorfizmu różnych genów kodujących enzymy naprawy DNA do oceny predyspozycji genetycznych w szacowaniu ekspozycji wypadkowej i wynikającego z niej zagrożenia człowieka i ryzyka utraty zdrowia analizowanego w oparciu o detekcję skutku biologicznego techniką cytogenetyki klasycznej (CA), molekularnej (FISH) i analizy DNA jądrowego metodą elektroforezy (SCGE).

2. Materiał badawczy będą stanowiły próbki wyizolowanych limfocytów pochodzących od około 50-100 osób z choroba nowotworową oraz 50-100 osób z grupy referencyjnej. Materiał biologiczny został pozyskiwany w ramach długoletniej współpracy Zakładu Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej IFJ PAN z Katedrą Urologii CM UJ, Katedrę Epidemiologii i Medycyny Zapobiegawczej CM UJ oraz Zakładem Medycyny Nuklearnej 5WSzKzP. Analizę polimorfizmów w wybranych genach: XRCC1 i XRCC3 proponuje się przeprowadzić z zastosowaniem metody PCR (tzw. semi-nested PCR). W tym celu planuje się zaprojektowanie primerów, a następnie przeprowadzenie optymizacji reakcji PCR pod detekcję produktu na żelu agarozowym.

3. Temat pracy magisterskiej jaki proponujemy pozwoli przygotować przyszłego absolwenta do pracy w warunkach bezpiecznych dla zdrowia. Podczas pracowni magisterskiej student zapozna się z podstawowymi zasadami bezpiecznej pracy w laboratorium i z materiałem biologicznym, a także z planowaniem eksperymentów. W trakcie badań student pozna podstawy teoretyczne i procedury praktyczne:

  • izolacji materiału biologicznego (DNA)
  • przeprowadzania reakcji PCR
  • przeprowadzania elektroforezy DNA w żelu agarozowym
  • analizy rezultatów rozdziału uzyskanych żeli
  • przygotuje bazę uzyskanych rezultatów
  • przeprowadzi analizę statystyczną uzyskanych rezultatów z zastosowaniem podstawowych testów statystycznych

oraz będzie miał możliwość dyskusji oraz ich prezentacji na forum Zespołu, także podczas seminariów i spotkań z gośćmi z ośrodków naukowych z którymi współpracuje Zakład.

4. Proponowany temat jest kontynuacją badań Zakładu Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej pod kierunkiem Prof. dr hab. A. Cebulskiej-Wasilewskiej z wieloma światowymi ośrodkami radiobiologicznymi [2].

5. Uzyskane rezultaty będą stanowić istotny wkład wpływu predyspozycji genetycznych na osobnicze zróżnicowanie odpowiedzi na promieniowanie X przy oszacowaniu dawki na wypadek zdarzeń radiacyjnych i będą mogły być wykorzystywane na potrzeby już istniejącego stanowiska szybkiej diagnozy dla potrzeb retrospektywnej dozymetrii na wypadek zdarzeń radiacyjnych w ramach Zakładu Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej IFJ PAN. Szczególną grupę stanowić będą pacjenci z choroba nowotworową, osoby poddawane terapii (np. radioterapii lub brachyterapii) lub badaniom diagnostycznym z udziałem radioizotopów oraz osoby pracujące z radionuklidami i urządzeniami wytwarzającymi promieniowanie jonizujące (np. z aparatami rentgenowskimi, akceleratorami, NMR). Istnieje ryzyko wystąpienia u nich skutków dodatkowego napromieniowania, konieczna jest więc ścisła kontrola otrzymywanych dawek i przestrzeganie zasad bezpieczeństwa pracy ze źródłami promieniowania, a także analiza wpływu polimorfizmu genów kodujących enzymy naprawy DNA do oceny predyspozycji genetycznych np. w ocenie skuteczności procedur leczniczych.

Piśmiennictwo:
[1] Cebulska-Wasilewska A (2003) Response to challenging dose of X-rays as a predictive assay for molecular epidemiology. Mut. Res. 544, 289-297.
[2] Norppa H (2004) Cytogenetic biomarkers and genetic polymorphisms, Toxicology Letters 149, 309-334.
[3] Cebulska-Wasilewska A, Wiecheć A, Panek A, Binkova B, Sram RJ, Farmer PB (2005) Influence of environmental exposure to PAHs on the susceptibility of lymphocytes to DNA-damage induction and on their repair capacity, Mutation Research 588, 73-81.
[4] Aka P, Mateuca R, Buchet J-P, Thierens H, Kirsch-Volders M (2004) Are genetic polymorphisms in OGG1, XRCC1 and XRCC3 genes predictive for the DNA strand break repair phenotype and genotoxicity in workers exposed to low dose ionising radiations? Mutation Research 556, 169-181.