Temat: Badania asocjacji pomiędzy uszkodzeniem DNA i chromosomów w oparciu o metody cytogenetycznej i molekularnej retrospektywnej dozymetrii biologicznej dawki pochłoniętej
(Studies of associations between DNA and chromosome damage based on cytogenetic and molecular methods of retrospective biological dosimetry)

Opiekun pracy: dr Agnieszka Panek, tel.: 662 83-68, 662 84-82
e-mail: Agnieszka.Panek@ifj.edu.pl


Kierunek: Fizyka Medyczna


Problem badawczy:
Zakład Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej posiada ogromne doświadczenie w zakresie dozymetrii biologicznej. Wynikiem i dorobkiem wieloletnich badań Prof. A. Cebulskiej-Wasilewskiej są krzywe standaryzacyjne zależności częstości aberracji chromosomowych od dawki uzyskane dla różnych wiązek terapeutycznych i rodzajów promieniowania [3]. Przykładem zastosowania posiadanych krzywych standaryzacyjnych dla potrzeb retrospektywnej dozymetrii biologicznej w przypadku niekontrolowanej ekspozycji radiacyjnej mogą być badania wykonane w Zakładzie w roku 1996, których celem było oszacowanie ryzyka utraty zdrowia w oparciu o określenie dawki pochłoniętej przez osoby poddane przypadkowej ekspozycji na promieniowanie gamma, a w 2009 r. dla osoby potencjalnie narażonej na promieniowanie podczas serwisowania aparatu RTG. W 2009 roku Zakład NZ55 pod kierownictwem Prof. A. Cebulskiej-Wasilewskiej przeprowadził szkolenie ("NATO Advanced Training Course "Rapid Diagnosis in Population at Emergency and Risk"- RADIPER, http://natoatcradiper.org/) w dziedzinie szybkiej biologicznej dozymetrii radiacyjnej i środowiskowej w sytuacjach awaryjnych i wypadkowych. Program kurs obejmował wykłady wybitnych specjalistów ze Stanów Zjednoczonych i Europy oraz laboratoryjne szkolenie grupy wyselekcjonowanych na drodze konkursu wysoce wyspecjalizowanych naukowców z 20 krajów. Zaprezentowany dorobek naukowy oraz doświadczenie zadecydowało, iż NZ55 wygrało przetarg w 2008 r. ogłoszony przez Prezesa PAA na wykonanie usługi polegającej na opracowaniu procedur pomiarowych oraz utworzeniu stanowiska szybkiej diagnozy dla potrzeb retrospektywnej dozymetrii na wypadek zdarzeń radiacyjnych i utrzymaniu go przez okres 3 lat - ZP Nr 11/2008. W oparciu o uzyskane doświadczenie, Zakład w 2011roku w ramach Zadania Badawczego nr 6 pt.: "Rozwój metod zapewnienia bezpieczeństwa jądrowego i ochrony radiologicznej dla bieżących i przyszłych potrzeb energetyki jądrowej" należącego do strategicznego projektu badawczego NCBiR pt. "Technologie wspomagające rozwój bezpiecznej energetyki jądrowej". Umowa Nr SP/J/6/143339/11 rozpoczął procedury dostosowywania posiadanych metodyk do wymogów akredytacyjnych.

Celem proponowanej pracy będzie analiza asocjacji pomiędzy uszkodzeniem DNA (DNA repair competence assay) i chromosomów (pomiar częstości chromosomów dwucentromerowych). W oparciu o uzyskane rezultaty w drugiej części pracy zostanie przeprowadzona optymalizacja dostosowawcza do wymogów akredytacji metody cytogenetycznej oraz molekularnej retrospektywnej dozymetrii biologicznej dawki pochłoniętej.

Metodyka badań:
Na potrzeby badań do pracy magisterskiej, magistrant zapozna się z metodami zarówno cytogenetycznej i molekularnej retrospektywnej dozymetrii biologicznej dawki pochłoniętej. Molekularna retrospektywna dozymetria biologicznej dawki pochłoniętej polega na ocenie indywidualnej radiowrażliwości i wydajności komórkowych procesów naprawy DNA w oparciu o zaproponowany przez A. Cebulską - Wasilewską, model badań wydajności naprawy DNA z zastosowaniem dawki pobudzającej promieniowania X [1,2,4,5]. Analiza indukowanych uszkodzeń DNA zostanie przeprowadzona metodą elektroforezy DNA jądrowego ekstrahowanego z pojedynczych komórek w żelu agarozowym (ang. SCGE) w pH>13 pozwalającą na ilościową detekcję uszkodzeń DNA takich jak pojedyncze i podwójne pęknięcia nici DNA, miejsca apurynowe oraz apirymidynowe. W oparciu o wykonane preparaty magistrant samodzielnie przeprowadzi ilościową analizę uszkodzeń DNA przy użyciu epifluorescencyjnego mikroskopu połączonego z kamerą CCD oraz komputerem zawierającym program do analizy obrazu Komet 3.0 firmy Kinetic Imaging (Liverpool, UK) stanowiący wyposażenie Zakładu.
W ramach pracy magistrant zapozna się również z cytogenetyczną metodą szacowania retrospektywnej dawki pochłoniętej opierającą się na pomiarze częstości chromosomów dwucentromerowych (CA). Magistrant przeprowadzi procedury, zakładania i utrwalania hodowli komórkowych oraz wykonywania i różnicowego barwienia metodą Hoechst plus Giemsa preparatów cytogenetycznych, zgodne z Technical Reports Series No. 405 Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment, IAEA, 2001 [6]. W związku z przystosowaniem technik stosowanych w badaniach naukowych do szybkiej diagnozy dla potrzeb retrospektywnej dozymetrii na wypadek zdarzeń radiacyjnych, a także do oceny radiowrażliwości komórkowej badanych dawców i pacjentów, oraz w celu przyspieszenia techniki analizy aberracji dla potrzeb klasycznej cytogenetyki magistrant będzie korzystał z przygotowanego w Zakładzie Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej IFJ PAN systemu automatycznego wyszukiwania metafaz oraz programu do analizy obrazu płytki metafazowej Metascan. Po zapoznaniu się z obydwiema technikami wykona analizy asocjacji pomiędzy uszkodzeniem DNA i chromosomów.
Równolegle do nauki prezentowanych powyżej metod magistrant zapozna się z wymogami Polskiego Centrum Akredytacyjnego dotyczącymi akredytacji metody badawczej i rozpocznie optymalizację dostosowawczą poznanych metod do wymogów akredytacji.

Uzyskane umiejętności:
Podczas wykonywania pracy magisterskiej magistrant:

  • zapozna się z procedurami bezpiecznej i sterylnej pracy z materiałem biologicznym człowieka,
  • nauczy się planowania i organizacji wykonania eksperymentów biologicznych,
  • posiądzie praktyczne umiejętności wykonywania testów:
    • DNA repair competence assay ,
    • cytogenetycznych,
  • przeprowadzi analizę asocjacji pomiędzy uszkodzeniem DNA i chromosomów,
  • zapozna się z wymogami i rozpocznie procedurę akredytacji poznanych metod.

Piśmiennictwo:
[1] Cebulska-Wasilewska A. (2002) Predictive Assay for Adverse Health Outcomes in Molecular Epidemiology, Przegląd Epidemiologiczny 56(2): 163-175.
[2] Cebulska-Wasilewska A.(2003) Response to challenging dose of X-rays as a predictive assay for molecular epidemiology. Mut. Res .544: 289-297.
[3] Cebulska-Wasilewska A., Kasper E., Wierzewska A., Huiskamp R., Lloyd D., (1997) RBE of 5.6 MeV and Fission Neutrons Assessed from hromosomal Aberrations in Human Blood Lymphocytes, Polish Journal of Medical Physics and. Eng. No 1 (7), V.3, 1-9.
[4] Cebulska-Wasilewska A., Binkova B, Sram RJ., Kalina I. , Popov T., Farmer PB. (2007) Repair competence assay in studies of the influence of environmental exposure to c-PAHs on individual susceptibility to induction of DNA damage Mut. Res. 620: 155-164.
[5] Gąsiorkiewicz J., Krzysiek M., Miszczyk J., Panek A., Pawlus J., Stępień A. and Cebulska-Wasilewska A.. Studies on response to the challenging dose of x-rays in lymphocytes of patients undergoing diagnosis and treatment with Iodine-131. NATO monograph: Rapid Diagnosis in Populations at Risk from Radiation and Chemicals, eds. A. Cebulska-Wasilewska, A.N. Osipov, F. Darroudi, IOS Press, NATO Science for Peace and Security Series E: Human and Societal Dynamics- vol. 73 ISBN 978-1-60750-644-7 (2010).
[6] Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment A Manual, International Atomic Energy Agency, Technical Reports Series No. 405, Vienna, 2001.