Temat: Badania skutków biologicznych oddziaływania terapeutycznej wiązki protonowej cyklotronu AIC-144 na poziomie molekularnym i chromosomowym w limfocytach krwi obwodowej
(Study of the biological effects of therapeutic proton beam from AIC-144 cyclotron at the molecular and the chromosome level in peripheral blood lymphocytes)

Opiekun pracy: dr Agnieszka Panek, tel.: 12 662 83-68, 12 662 84-82
e-mail: Agnieszka.Panek@ifj.edu.pl


Kierunek: Fizyka Medyczna


Problem badawczy:
Celem proponowanej pracy jest zbadanie skutków biologicznych oddziaływania terapeutycznej wiązki protonowej cyklotronu AIC-144, stosowanej w Narodowym Centrum Radioterapii Hadronowej IFJ PAN, poprzez wyznaczenie zależności dawka (0-4Gy) - skutek dla poziomu uszkodzeń DNA (ang. comet assay lub SCGE) oraz częstości aberracji chromosomowych (CA) mierzonych w limfocytach krwi obwodowej. Celem wyznaczenia względnej skuteczności biologicznej (RBE) badanej wiązki terapeutycznej, uzyskane rezultaty zostaną porównane w odniesieniu do skutku biologicznego wywoływanego działaniem promieniowania X. Wyniki proponowanych badań mają być wsparciem dla fizycznych metod charakterystyki wiązki terapeutycznej oraz będą stanowiły materiał porównawczy w przyszłych badaniach radiobiologicznych planowanych dla nowej wiązki terapeutycznej z cyklotronu Proteus C-235.

Metodyka badań:
Materiał biologiczny w proponowanych badaniach będą stanowiły zarówno krew obwodowa człowieka jak i izolowane limfocyty.
Na potrzeby badań do pracy magisterskiej, magistrant zapozna się z metodami zarówno cytogenetycznej i molekularnej dozymetrii biologicznej dawki pochłoniętej. Analiza poziomu indukowanych uszkodzeń DNA zostanie przeprowadzona metodą elektroforezy DNA jądrowego ekstrahowanego z pojedynczych komórek w żelu agarozowym (ang. SCGE) w pH>13, znanej również jako test kometowy, pozwalającą na ilościową detekcję uszkodzeń DNA takich jak pojedyncze i podwójne pęknięcia nici DNA, miejsca apurynowe oraz apirymidynowe [1]. W oparciu o wykonane preparaty magistrant samodzielnie przeprowadzi ilościową analizę uszkodzeń DNA przy użyciu epifluorescencyjnego mikroskopu połączonego z kamerą CCD oraz komputerem zawierającym program do analizy obrazu Komet 3.0 firmy Kinetic Imaging (Liverpool, UK) stanowiący wyposażenie Zakładu.

Fot.1. Ślad DNA limfocytów obserwowany po zastosowaniu metody elektroforezy pojedynczych komórek w żelu agarozowym

W ramach pracy magistrant zapozna się również z cytogenetyczną metodą szacowania dawki pochłoniętej opierającą się na pomiarze częstości chromosomów dicentrycznych (CA) uznawaną jako tzw. "gold standard". Magistrant przeprowadzi procedury, zakładania i utrwalania hodowli komórkowych oraz wykonywania i różnicowego barwienia metodą Hoechst plus Giemsa preparatów cytogenetycznych, zgodne z Technical Reports Series No. 405 Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment, IAEA, 2001 [2]. W celu przyspieszenia techniki analizy aberracji magistrant będzie korzystał z przygotowanego w Zakładzie systemu automatycznego wyszukiwania metafaz oraz programu do analizy obrazu płytki metafazowej Metascan.

Fot. 2. Zdjęcie metafaz w pierwszym podziale mitotycznym do analizy chromosomowych aberracji (CA).

Określenie charakterystyki wiązki polegać będzie na zbadaniu:

  • Zależności dawka-skutek w zakresie dawek 0-4Gy, poprzez pomiar ilości uszkodzeń DNA oraz częstości chromosomów dicentrycznych bezpośrednio po zastosowaniu różnych dawek promieniowania protonowego emitowanego przez cyklotron.
  • Względnej skuteczności biologicznej, poprzez porównanie otrzymanych wyników dla wiązki protonowej z wynikami dla promieniowania X uzyskanymi w analogicznych eksperymentach, gdzie źródłem promieniowania będzie aparat rentgenowski Philips MGM-323.
  • Asocjacji pomiędzy poziomem uszkodzeń DNA a częstością chromosomów dicentrycznych.

Uzyskane umiejętności:
W czasie wykonywania pracy magisterskiej student nabędzie umiejętności z zakresu:

  • zasad bezpieczeństwa i higieny pracy w laboratorium, z uwzględnieniem zagrożeń czynnikami biologicznymi, chemicznymi i fizycznymi
  • planowania eksperymentów badawczych
  • prac laboratoryjnych, dotyczących:
    • izolacji limfocytów
    • przygotowania preparatów w żelu agarozowym
    • elektroforezy DNA
    • analizy uszkodzeń DNA
    • zakładania i utrwalania hodowli komórkowych
    • wykonywania preparatów cytogenetycznych
  • budowy i zasady działania cyklotronu AIC-144
  • opracowania i analizy statystycznej wyników badań oraz ich prezentacji

Student będzie miał możliwość zaprezentowania wyników badań na seminariach organizowanych w IFJ PAN (zakładowych, oddziałowych).

Piśmiennictwo:
1. Cebulska-Wasilewska A (2003) Response to challenging dose of X-rays as predictive assay of molecural epidemiology. Mut. Res. 544:289-297.
2. Cytogenetic Analysis for Radiation Dose Assessment A Manual, International Atomic Energy Agency, Technical Reports Series No. 405, Vienna, 2001.